2021-11-05 10:45

肽结合的morpholino寡聚物能有效抑制vero细胞中的SARS-CoV-2

鉴于2019冠状病毒病(COVID-19)大流行,寻找抗病毒药物的速度达到了前所未有的水平。这种疾病的病原体——严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)——已经在全世界感染了5200多万人,并随后夺走了130多万人的生命。然而,在无数有望帮助对抗病毒并减轻其损害的候选药物中,还没有一种进入临床。

美国的一组研究人员探索了一种创新的直接作用抗病毒药物,肽类共轭morpholino低聚物(PPMO),及其对SARS-CoV-2的疗效。来自美国国家过敏症和传染病研究所、美国国家卫生研究院和卡尔森兽医学院的研究人员在《美国国家过敏症和传染病杂志》上发表了他们的积极观察。

Study: Inhibition of SARS-CoV-2 in Vero cell cultures by peptide-co<em></em>njugated morpholino oligomers. Image Credit: NIAID

肽结合的morpholino寡聚物(PPMO)是一种反义化合物,由二氨基膦酸的morpholino寡聚物共价结合到穿透细胞的肽上。它们是水溶性分子,可以无缝地进入细胞并与目标分子结合。由于它们对核酸酶具有抗性,且在有效浓度下无毒,因此PPMOs是对抗SARS-CoV-2的良好候选药物。先前的研究也表明,针对病毒序列的鼻内注射PPMO可以降低病毒滴度和肺组织的病理学。

PPMO是单链核酸类似物;这些分子可以在没有帮助的情况下进入细胞,并通过靶向RNA的空间位阻来干扰基因表达。

在他们的研究中,研究人员使用5个PPMOs靶向SARS-CoV-2的5'UTR和多聚蛋白1a/b翻译起始位点(AUG)区域的不同位点。众所周知,冠状病毒基因组的5'UTR区域包含重要的序列和结构,在病毒生命周期的各个方面都是必不可少的,包括翻译和RNA合成。

研究人员设计的PPMO靶向SARS-CoV-2阳性意义基因组RNA的5'UTR和第一个翻译起始位点区域。他们发现,靶向基因组RNA 5 '末端区域和TRS前导转录调节序列(leading transcription regulatory sequence, TRS)区域的PPMOs是SARS-CoV-2复制的有效抑制剂。

这项研究是在Vero E-6细胞中进行的,这是一种主要用于疫苗或研究实验的细胞培养的细胞系。因此,研究中使用的每一种PPMO都评估了其对未感染细胞活力的影响以及对Vero细胞培养中SARS-CoV-2复制的抑制作用。

其中两个PPMOs (5 ' end -1和5 ' end -2)靶向基因组的5 '末端区域,干扰基因组和亚基因组信使rna (mRNAs)翻译的预启动。另外两起针对TRS地区;TRS是一个6-10核苷酸序列,在mRNA合成过程中负链mRNA模板的生成中起关键作用。第五种PPMO命名为AUG,靶向SARS-CoV-2 1a/b多聚蛋白AUG翻译起始位点。

在本研究中,阴性对照是一个随机序列的PPMO -来控制任何非特异性的PPMO结合。设计的阴性对照与任何灵长类动物、啮齿动物或病毒序列几乎没有显著的同源性。

他们发现,剂量依赖的抗病毒试验和细胞活力定量试验产生的细胞毒性效应不超过5%。

然而,他们观察到,各种PPMO对SARS-CoV-2复制的抑制作用是非常有效的,可将病毒滴度降低4-6 log10。

在这项研究中使用的五种抗病毒PPMOs中,有四种显示出成功的结果。研究人员在本研究中发现靶向5 '末端区域或leader-TRS区域的PPMOs对抑制SARS-CoV-2的生长非常有效。相比之下,靶向多聚蛋白1a/b AUG翻译起始位点的PPMO效果较差。PPMOs也表现出持久的效力。

Effect of PPMO on cell viability and SARS-CoV-2 growth. (a) e<em></em>valuation of the effect of PPMO treatment on cellular ATP level, as an indicator of cell viability, was carried out using uninfected cells incubated for 48 h with increasing co<em></em>ncentrations of the indicated PPMO. ATP levels were determined via luminescence readings and are shown compared with PBS-treated cells. For each PPMO concentration, triplicate samples were assayed and the mean±SD is shown. (b–m) Growth curves of SARS-CoV-2. Vero-E6 cells were treated with the indicated co<em></em>ncentration of PPMO for 5 h before infection with SARS-CoV-2 (moi of 0.01), then incubated without PPMO after infection. Cell supernatants were collected at 12, 24, 48 and 72 h post-infection and analysed by qRT–PCR (b–g) or TCID50/mL endpoint dilution (h–m) using three technical repeats. Cells treated with PBS had titres similar to those shown for NC PPMO. The limit of virus detection for the TCID50 assay was 101/mL. This experiment was carried out twice, under similar conditions, yielding similar results, and the results from a single experiment are shown. This figure appears in colour in the o<em></em>nline version of JAC and in black and white in the print version of JAC.

总的来说,该研究成功地证明了针对SARS-CoV-2的PPMOs容易进入细胞,并以序列特异性、剂量响应性和无毒的方式抑制病毒复制。

这一发现为进一步开发5'END和TRS PPMO来解决SARS-CoV-2感染提供了依据。也许寻找抗病毒分子到这里就结束了。