斯托尔斯医学研究所(Stowers Institute for Medical Research)的研究人员已经精细调整了一种方法，可以精确定位大型多蛋白复合物中相互接近或可能直接相互作用的表面。
在2020年4月14日在线发表于《细胞报告》(Cell Reports)的一篇论文中，Washburn实验室的成员描述了三种方法的组合——亲和标签蛋白纯化、高分辨率质谱化学交联、以及利用蛋白质对接的计算分子建模——以捕获Sin3/HDAC蛋白复合物内邻近表面的信息。
斯托尔斯蛋白质组学中心主任迈克尔·沃什伯恩博士解释说:“把所有这些碎片放在一起，让我们对蛋白质复合物是如何组合的有了一个新的视角。”这有可能更快地提供更多的信息。
沃什伯恩说:“所有的能力都已经存在了，而且已经联合使用了一些，但还没有大量使用。”“这当然是对现有技术的补充，如核磁共振(NMR)、低温电子显微镜(EM)和x射线晶体学，以真正了解蛋白质复合物如何组装，并看看——它们是如何真正相互作用的?”当你用药物或突变干扰它们时会发生什么?”
Sin3/HDAC复合物通过将组蛋白去乙酰化酶(HDACs)带到基因组的特定位置并从组蛋白尾部移除乙酰基，从而抑制基因转录，从而在染色质重塑和人类癌症生物学中发挥作用。尽管Sin3/HDAC复合物的成分已经得到了很好的定义，但使用任何一种技术都难以实现对大型多蛋白复合物的高分辨率描述。
沃什伯恩实验室的研究专家、论文的第一作者之一查尔斯·班克斯博士说，单凭质谱法的问题是，“我们只能识别管中的蛋白质。”我们不知道哪些蛋白质在物理上与哪些蛋白质相互作用。”
班克斯解释说，虽然可以对单个蛋白质相互作用进行分析，但它们通常是时间密集型的。“如果我们能在分离蛋白质之前捕捉到完整复合物的一些结构信息，那将是非常好的，这就是交联的作用所在。”
在这项研究中使用的交联剂，二琥珀酰亚砜(DSSO)，可以交联蛋白质复合物中的氨基酸-特别是赖氨酸残基-彼此之间约30埃。沃什伯恩说，它“在新的质谱仪中做了一些非常聪明的事情”——它可以被裂解，本质上提供了交联肽的指纹。
“如果我看到两个赖氨酸残基之间的交联，这意味着在完全完整的折叠蛋白质中，这些赖氨酸非常接近，给了我们位置信息，”班克斯解释说。“如果我有两个不同的蛋白质，两个赖氨酸残基——每个蛋白质都有一个——交联在一起，这意味着这两个蛋白质中的赖氨酸通常非常接近，这与蛋白质相互作用是一致的。”
然后，班克斯说，他们能够利用蛋白质间的交联信息，试图将现有的晶体结构连接在一起，类似于组装3D拼图的碎片。
在这项由Banks和蛋白质组学中心科学家Ying Zhang博士领导的研究中，Stowers的研究人员使用HaloTag亲和纯化和SAP30L亚基作为诱饵，从HEK293T细胞中分离出Sin3/HDAC复合物。在化学交联后，他们发现13个Sin3亚基有66个蛋白间交联和63个自交联，他们能够利用分子建模确定5个亚基(SAP30L、HDAC1、SUDS3、HDAC2和ING1)在Sin3A支架周围的相对位置。
“但是为什么除了HDACs还有其他的亚基呢?为什么不直接招募hdac呢?”他问道。“我们认为，Sin3复合物可能控制一组特定基因的转录，可能在特定的时间和地点，在特定的细胞中，我们认为其他亚基可能控制这种特异性。”
当被问及未来的研究方向时，班克斯回答说:“目前我们的交联剂有点有限，因为它只会捕捉基于两个赖氨酸彼此接近的信息。”如果有不同的交联剂可以在其他氨基酸之间进行交联，这将是非常好的，特别是如果我有另一种我喜欢的蛋白质，我想研究，它的序列中没有很多赖氨酸。”
用交联信息进行分子建模“就像为获得真正大型复合体的完整结构打下基础，这是很难做到的，”Washburn说。
“在未来，我们可以想象我们目前所做的，并尝试对这些组件进行低温电磁成像，看看两个数据集如何相互补充。低温电子显微镜是一项惊人的技术，将其与交联质谱联用可以更清晰地描绘出这些分子在实际界面上的样子，”Washburn解释道。
“这是一系列技术的融合，使我们能够在几乎任何情况下对任何蛋白质复合物进行研究”，甚至是为了理解冠状病毒蛋白质与人类蛋白质复合物的相互作用。
“我已经很久没有对新功能如此兴奋了，”他说。
这项工作的其他合著者包括Sayem Miah博士，Yan Hao, Mark K. Adams博士，Zhihui Wen, Janet L. Thornton和Laurence Florens博士。
这项工作由Stowers医学研究所和美国国立卫生研究院的国家普通医学科学研究所资助(RO1GM112639授予MPW, F32GM122215授予MKA)。内容完全是作者的责任，并不一定代表国家卫生研究院的官方观点。
调查结果概要
Sin3/HDAC是一个大型的多蛋白复合物，通常负责“关闭”一组特定的基因。当其主要支架发生突变时，该复合物也与癌症生物学有关，并被用于许多人类癌症的治疗，包括三阴性乳腺癌和胰腺癌。尽管Sin3/HDAC已经得到了很好的研究，并且已经确定了它的组成亚基，但是要清楚地了解这些亚基是如何组装的仍然很困难。
斯托尔斯医学研究所(Stowers Institute for Medical Research)的迈克尔·沃什伯恩(Michael Washburn)博士及其实验室长期以来一直使用蛋白质组学和蛋白质质谱技术研究蛋白质网络中的复合物。在过去的几年里，一些技术得到了改进，当结合在一起时，允许研究人员获得关于多蛋白复合物中相邻表面空间排列的明确信息。
沃希伯恩实验室于2020年4月14日在线发表在《细胞报告》(Cell Reports)上的一份报告描述了使用现有的三种方法——亲和标签蛋白质纯化、高分辨率质谱化学交联和蛋白质对接计算分子建模——来精确定位特定表面，在完整的蛋白质复合物中，它们彼此非常接近。
他们总共鉴定了13个Sin3/HDAC亚基的66个蛋白间交联(在两个不同的蛋白之间)和63个自交联(在同一蛋白内)，其中一些是互斥的。
这些方法的组合在过去偶尔被使用过，但随着时间的推移，这种组合技术可能会被更多地使用，使研究人员能够精确地确定从任何来源获得的几乎任何蛋白质复合物中的相互作用表面。这些功能可以进一步结合其他强大的技术，如低温电子显微镜，以提供更高分辨率的图像，在界面表面的相互作用，在完整的蛋白质复合物。
